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| ISTITUTO SPERIMENTALE PER LA CEREAICOLTURA, SOP di FOGGIA S.S. 16 km 675 – 71100 FOGGIA Tel. 0881 742972; 0881 714911 – Fax 0881 713150; |
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LA STORIA Nel 1919 lIstituto Nazionale di Genetica per la Cerealicoltura attraverso lacquisizione della tenuta Masseria Manfredini costituμ a Foggia la Stazione di Fitotecnica per le Puglie.
Con questa ricca dotazione fondiaria iniziò, subito dopo, un’intensa attività basata inizialmente nella moltiplicazione e conservazione in purezza dei nuovi frumenti, costituiti a Rieti dal Prof. Nazareno Strampelli. In seguito, anche il miglioramento genetico del frumento duro fu uno dei principali obiettivi messi in itinere da questa Sezione. Il D.P.R. n. 1318 del 23 novembre 1967 diede una svolta alla sperimentazione agraria e, in particolare, l’art. 10 riportava la nascita dell’Istituto Sperimentale per la Cerealicoltura che istituzionalmente “provvede agli studi ed alle ricerche riguardanti la genetica dei cereali, la costituzione di varietà di frumento, mais, riso e cereali minori, nonché la tecnica di coltivazione delle medesime”.
Nel 1975 venne, infine, costruita l’attuale sede della SOP di Foggia che oggi vanta una superficie aziendale di 145 ettari, di cui 20.500 metri quadrati adibiti a diverse strutture così identificate:
Nello schema sottostante sono riassunti i vari ambiti di ricerca ed i relativi campi applicativi:
SINTESI DELLE ATTIVITA’ DI RICERCA
MIGLIORAMENTO GENETICO e COSTITUZIONE VARIETALE
L’attività di miglioramento genetico del frumento duro è indirizzata verso la costituzione di nuove varietà con migliorate caratteristiche di adattamento agli ambienti difficili del sud Italia (scarse precipitazioni e alte temperature). I programmi di breeding prevedono l’esecuzione di incroci e la selezione dei migliori genotipi mediante selezione ricorrente o metodo pedigree. Le linee vengono selezionati sulla base di caratteristiche produttive (elevata stabilità produttiva e resistenza agli stress biotici ed abiotici) e qualitative, (elevato contenuto in pigmenti -indice di giallo- elevata attitudine alla plastificazione). Si affianca al miglioramento genetico classico, l’uso della mutagenesi artificiale al fine di elevare il livello di variabilità genetica così come l’uso delle moderne tecniche di ingegneria genetica e della trasformazione del DNA ricombinante. Il lavoro svolto fino ad oggi ha portato alla costituzione di varietà di frumento duro di pregio come Tavoliere (1984), Adamello (1985), Ofanto (1990), Fortore (1995), Gargano e Varano (1997), Lesina (1998), Bradano e Vesuvio (1999), Chiara, Ghibli, Sfinge, Sorriso e Turchese (2003) che già iscritte al Registro Nazionale delle Varietà, sette nuovi genotipi dotati di elevata produttività e adattabilità ai climi meridionali sono attualmente in corso di iscrizione.
L’attività di miglioramento genetico dell’orzo è stata indirizzata prevalentemente verso la selezione di genotipi adatti alla coltivazione negli ambienti dell’Italia meridionale, con elevata capacità produttiva e con buone caratteristiche qualitative sia per l’alimentazione animale che la produzione di malto. Nel 1993 si è giunti all’iscrizione nel Registro Nazionale delle Varietà della varietà Diomede (polistico, alternativo, precoce, idoneo anche al pascolamento) e nel 1999 della varietà Dasio (distico, alternativo, di elevata produttività, bassa taglia).
Da oltre 15 anni l’Istituto si occupa del miglioramento genetico del farro, termine che identifica alcune specie di frumenti vestiti coltivati come Triticum monococcum L. (farro piccolo), Triticum dicoccum Schübler (farro medio) e Triticum spelta L. (farro grande o spelta). La crescente richiesta di prodotti a base di farro ha fatto aumentare l’interesse verso questi cereali è stato perciò avviato un programma di miglioramento genetico volto a selezionare linee di farro produttive e con buona attitudine panificatoria. La selezione operata mediante il metodo per pedigree ha portato alla costituzione di seguenti genotipi di farro: varietà Davide (1997), Mosè e Padre Pio (1999) (incrocio farro dicocco molisano x Simeto); linee 172 R, 209 R e 223 R (incrocio farro dicocco molisano x Ofanto); linea P 12 (incrocio farro spelta Altgold Rotkorn x Centauro), linea B 1030 (incrocio farro spelta Altgold Rotkorn x Bolero) e linee S 2013 e S 2070 (incrocio farro spelta Altgold Rotkorn x Spada).
La sezione di Foggia dell’Istituto Sperimentale per la Cerealicoltura organizza e coordina la Rete nazionale di confronto varietale tra frumenti duri in collaborazione con numerose istituzioni pubbliche e private al fine di definire l’adattabilità delle varietà ai diversi ambienti, di fornire notizie univoche sulle caratteristiche delle varietà in prova e di indirizzare la scelta delle varietà da coltivare.
BIOCHIMICA: Stress ossidativo e sistemi antiossidanti negli stress abiotici, nella senescenza e nei processi tecnologici di trasformazione
Ruolo dei mitocondri nella resistenza agli stress abiotici in frumento duro
Esistono diversi meccanismi di difesa messi in atto dai mitocondri vegetali per contrastare l’azione dei ROS. Tra questi è importante la prevenzione della produzione mitocondriale dei ROS ad opera dei sistemi dissipativi localizzati a livello della membrana mitocondriale interna: la proteina di disaccoppiamento, PUMP, il canale del K+, PmitoKATP, e l’ossidasi alternativa, AOX. Si tratta di proteine il cui funzionamento determina un abbassamento del potenziale elettrico di membrana, DY, e della produzione di ROS. Nelle prime fasi di sviluppo, la PUMP ed il PmitoKATP, ma non l’AOX, sono attivati in condizioni di stress iperosmotico secondo il seguente meccanismo: lo stress induce un aumento della produzione mitocondriale di ROS e di acidi grassi liberi, entrambi attivatori di PUMP e PmitoKATP; i due sistemi dissipativi attivati tendono a dissipare il DY e, così, a ridurre l’ulteriore produzione di ROS secondo un meccanismo a “feed-back”. Per contro, l’AOX è risultata essere attivata dagli intermedi del ciclo fotorespiratorio, in particolare da gliossilato e idrossipiruvato; questo suggerisce che l’AOX possa essere attivata nei tessuti verdi quando, in condizioni di stress ambientali, il ciclo fotorespiratorio è particolarmente attivo.
Caratterizzazione di mutanti di frumento duro “stay green” Questa linea di ricerca riguarda la caratterizzazione fisiologica e molecolare di mutanti di frumento duro con fenotipo “stay-green”. Sono in corso indagini finalizzate alla valutazione, in tre linee di mutanti e nel genotipo parentale (cv Trinakria), dell’attività di enzimi di cui è nota l’implicazione nei processi di senescenza cellulare. Si tratta di enzimi con funzione antiossidante (Superossido Dismutasi, SOD, Catalasi, CAT, Perossidasi, POX) e di enzimi in grado di fornire il potere riducente, sotto forma di NADPH, necessario per mantenere i componenti cellulari in uno stato di maggiore riduzione (Glucosio-6-fosfato Deidrogenasi, G6PDH, ed Enzima Malico, ME). In aggiunta, le indagini stanno riguardando anche la valutazione dello stato redox della cellula mediante la misura del contenuto totale del gruppi –SH relativi alle proteine ed al glutatione ridotto. Nel periodo post-fioritura le linee di mutanti stay green presentano un’attività fotosintetica che si mantiene più a lungo rispetto al genotipo parentale. Nello stesso periodo le linee mutanti mostrano una più elevata attività di SOD, CAT e G6PDH, nonché un più elevato contenuto di gruppi –SH. Ciò suggerisce che il ritardo nella senescenza, che caratterizza i mutanti “stay green”, potrebbe essere la conseguenza di più efficienti meccanismi antiossidanti di difesa, che intervengono all’inizio della senescenza e che comprendono sia la detossificazione dai ROS sia il rifornimento di potere riducente sotto forma di NADPH, entrambi necessari a mantenere i componenti cellulari in uno stato di maggiore riduzione.
Ruolo della Lipossigenasi (LOX) nello sbiancamento della semola durante il processo di pastificazione
L'attività di LOX è stata caratterizzata nell'estratto di semola determinandone, mediante tecniche spettrofotometriche e polarografiche, la dipendenza dal pH, dalla temperatura, dalla quantità di enzima e dal substrato (Km e Vmax), nonché la variabilità genotipica in diverse varietà. Successivamente è stato caratterizzato, in vitro, l’effetto inibitorio dell’a-tocoferolo, dell’ascorbato e del b-carotene sull’attività dell’enzima. E’ stato, inoltre, studiato più nel dettaglio il meccanismo di co-ossidazione dei pigmenti ed altre reazioni collaterali quali la generazione di ossigeno singoletto e di composti carbonilici usando la isoforma LOX-1 di soia. Relativamente al dosaggio di PLA2, è stata dimostrata per la prima volta l’esistenza di PLA2 in mitocondri vegetali.
Collaborazioni esterne Prof. Donato Pastore, Università degli Studi di Foggia. Prof.ssa Zina Flagella, Università degli Studi di Foggia. Dr Giuseppe Spano, Università degli Studi di Foggia.
BIOLOGIA MOLECOLARE Colture in vitro e trasformazione Sono state definite le condizioni ottimali per ottenere colture cellulari embriogeniche altamente rigenerabili di frumento duro da utilizzare come sistema accettore in esperimenti di trasformazione genetica. Sono state inoltre definite le condizioni per un utilizzo efficiente e riproducibile della trasformazione con metodo biolistico. In particolare, sono stati individuati i parametri ottimali relativi alla tecnica di trasformazione (pressione di He usata per lo sparo, distanza microproiettili-bersaglio, tipo di microproiettili e quantità da usare per ogni sparo, quantità di DNA plasmidico da far precipitare su tali particelle) e allo stadio della coltura in vitro (scutelli di embrioni immaturi, infiorescenze immature, colture embriogeniche) in cui le cellule sono più rispondenti. Allo stesso tempo, è stato messo a punto il protocollo di selezione e di rigenerazione delle cellule trasformate. Lo strumento utilizzato per il bombardamento cellulare è il Biolistic PDS-1000/He della BioRad. Attraverso il sistema biolistico sono state ottenute piante geneticamente modificate per resistenza alla fosfinotricina, principio attivo dell’erbicida BASTA, e a patogeni fungini e anche piante in cui è stato modificato il trasporto cellulare di proteine tra il reticolo endoplasmatico e l’apparato del Golgi, con effetti sulle proprietà funzionali delle proteine del glutine. Le prime sono state studiate in campo (autorizzato dal Ministero della Salute) per valutare la stabilità del transgene e la sua interazione con la microflora del suolo. Le piante con i geni di resistenza ai patogeni fungini sono in corso di studio per valutare l’espressione a livello molecolare e fenotipico della proteina inserita ed i semi di quest’ultime sono stati moltiplicati (notifica approvata da Ministero della Salute) e sono in corso studi per valutare l’effetto della modifica sulle proprietà reologiche degli impasti. Attualmente, l’attività di ricerca è orientata verso il trasferimento di un fattore di trascrizione di orzo implicato nell’induzione di tolleranza a stress abiotici, in particolare freddo e siccità.
Nel corso di un programma di ricerca finalizzato all’isolamento di geni candidati per un ruolo di regolazione nei meccanismi di resistenza allo stress da freddo, sono stati isolati 15 geni di frumento duro. Alcuni di essi sono regolati anche da stress idrico Attualmente è in corso la caratterizzazione funzionale di questi geni mediante approcci molecolari, biochimici e genetici (analisi di linee knock out di orzo e Arabidopsis), nell’ambito del progetto Agronanotech finanziato dal MiPAF. Molti dei geni con funzione di regolazione della risposta della pianta allo stress codificano per fattori trascrizionali in grado di regolare l’espressione di molti geni a valle nella cascata di trasduzione del segnale da tress, i cui prodotti contribuiscono all’acquisizione della tolleranza. CorWRKY38 è un gene codificante per un fattore trascrizionale della famiglia WRKY, caratterizzata dalla presenza del dominio “WRKYQ” isolato in orzo come gene indotto da bassa temperatura e disidratazione presso la sez. di Fiorenzuola. Il progetto Miglioramento Tolleranza a Stress (MiPAF) si propone di verificare sperimentalmente il ruolo molecolare di corWRKY38 e di valutare il coinvolgimento di questo gene nei meccanismi di resistenza a freddo e siccità nelle piante. Presso la sezione di Foggia è in corso lo studio funzionale di questo gene mediante realizzazione di piante di frumento duro in grado di sovra-esprimere corWRKY38. L’analisi dell’espressione genica in condizioni di stress idrico viene condotto anche a livello genomico (Progetto Genoma Frumento Duro MiPAF), mediante la costruzione di librerie di sottrazione con il metodo "PCR select", che permette di ottenere una libreria notevolmente arricchita in cDNA espressi in modo differenziale tra il campione esposto allo stress e il controllo, e mediante analisi microarray, che permette di monitorare l’espressione di decine di migliaia di geni contemporaneamente. E’ inoltre in corso la realizzazione di tre mappe genetiche in frumento duro per caratteri di grande importanza come produzione e qualità in ambienti caratterizzati da carenza idrica. L’uso di mappe genetiche è fondamentale per studiare caratteri sia qualitativi che quantitativi ed individuare le regioni del genoma che li controllano. E’ inoltre in corso lo studio sistematico della variabilità genetica del frumento duro per caratteri quali produzione ed efficienza nell’uso dell’acqua. Gli studi di associazione tra caratteri agronomici rilevati in campo e frequenza di determinati alleli ai loci di geni correlati con la risposta allo stress, e lo sviluppo di mappe genetiche con marcatori molecolari su geni espressi, consentiranno di chiarire il ruolo funzionale di molti geni candidati nei meccanismi di tolleranza agli stress abiotici in frumento duro.
Prof. Michele Morgante dell’Università di Udine; Prof. Antonio Blanco dell’Università di Bari.
FISIOLOGIA VEGETALE: Caratterizzazione di mutanti per la resistenza a stress idrico e salino
La conoscenza di meccanismi di tolleranza e/o di genotipi normalmente resistenti agli stress abiotici può favorire la coltivazione anche nelle condizioni pedo-climatiche particolarmente difficili e normalmente sfavorevoli per la generalità di piante agrarie. Lo studio delle basi fisiologiche dello resistenza allo stress idrico è realizzato con l’uso di mutanti di frumento duro. In particolare, il mutante 422 mostra una superiore capacità, rispetto al wild-type, di accumulare ioni K+ nelle foglie e una superiore resistenza allo stress salino. Il mutante 364 si caratterizza rispetto al wild-type per una marcata alterazione dell’entalpia di idratazione dell’acqua legata, del Q10 dell’acqua, della ritenzione idrica al massimo turgore ed altri parametri correlati. Nella tabella seguente sono riportati i dati relativi ad una prova condotta seminando nello stesso vaso i due genotipi e irrigando gli stessi con soluzioni crescenti di NaCl. Raffrontato al controllo, il M 422 mostrava una superiorità sia nella capacità germinativa (fino a 250 mM di NaCl, circa il 50% della concentrazione dell’acqua di mare) che nell’altezza delle piante nate. Inoltre, anche a parità di concentrazione salina il mutante mostrava di essere più tollerante rispetto al wild-type.
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L’attività si sviluppa essenzialmente come monitoraggio costante del materiale genetico costituito adottando di volta in volta metodi differenti. Per quanto concerce le 
