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Compiti statuari Miglioramento genetico e tecnica colturale del mais e del sorgo. L’attività della Sezione è stata principalmente indirizzata allo studio di problematiche agronomiche del mais, scelte varietali, miglioramento genetico, fisiologia della produzione, genetica di base, biologia molecolare e manipolazione degli acidi nucleici con le nuove tecnologie dell’ingegneria genetica.
Cenni storici La Sezione di maiscoltura di Bergamo è stata costituita nel 1920, grazie al contributo di diversi enti e istituzioni locali. Dal 1968 è parte dell’Istituto Sperimentale per la Cerealicoltura. Fin dall’inizio la stazione ha contribuito allo sviluppo della maiscoltura italiana con la creazione di varietà adatte alle condizioni pedoclimatiche nazionali e, nell’immediato dopoguerra, con l’introduzione e l’adattamento dei mais ibridi. Attualmente il centro svolge attività di ricerca prevalentemente indirizzata al miglioramento genetico del mais. Particolarmente curato è il settore scientifico, che riguarda l’approccio genetico alla produttività. Questo, grazie all’enorme aumento della resa produttiva degli ibridi di mais oggi coltivati, che permette un rapido ammortamento del costo della ricerca per gli operatori.
Ricerche svolte negli ultimi 10 anni Gli interessi scientifici ed operativi della Sezione sono indirizzati a ricerche sia di base che applicate al miglioramento genetico del mais condotte nel quadro di progetti finalizzati di interesse nazionale ed europeo. In particolare, gli attuali temi di ricerca e sperimentazione della Sezione riguardano le problematiche agronomiche, la scelta varietale, il miglioramento genetico, la fisiologia della produzione, la genetica formale e quantitativa, la genetica biochimica, fisiologica e cellulare, la biologia molecolare e studi avanzati sull’organizzazione del genoma del mais. In seguito vengono riassunte le principali linee di ricerca svolte nel periodo considerato.
Miglioramento genetico del mais Contesto tecnico scientifico Il mais rappresenta una coltura di riferimento precisa nel panorama agricolo italiano, e in quello padano in particolare. E’ prevedibile che la maiscoltura in Italia assumerà un ruolo più preciso con l’attuazione del programma di radicale riforma della Pac. Infatti, una cerealicoltura competitiva a supporto degli allevamenti dovrà necessariamente basarsi nel nostro Paese, e nelle aree vocate del sud Europa, sulla coltivazione del mais. E’ altresì utile sottolineare che questo cereale è prezioso per la molteplicità dei prodotti alimentari e industriali che fornisce. La ricerca vuole garantire l’intervento in loco sul miglioramento genetico di questa pianta per massimizzarne la produttività di granella e di trinciato integrale, per sviluppare materiali di base dotati di caratteri morfofisiologici per massimizzare la produzione quanti-qualitativa in condizioni di elevate concimazioni e di irrigazione e in condizione di low input energetico e per la formazione di ibridi adatti al nostro ambiente sempre più stabili e produttivi e per impieghi speciali.
Metodi utilizzati - Metodi di selezione ricorrente fenotipica e per progenie FS, S1, S2, HS, testcross - Metodi di selezione per pedigree - Prove parcellari replicate - Analisi qualità dei trinciati - Metodi di analisi quantitative - Metodi di valutazione della risposa alla selezione - Metodi di analisi per composti antiossidanti e amido resistenti
Risultati I risultati conseguiti hanno permesso il conseguimento dei seguenti obiettivi: - Costituzione varietà sintetiche per produzione granella e trinciato - Costituzione linee pure per la produzione di trinciato e per la produzione di granella - Valutazione della risposta alla selezione in sintetiche a base genetica stretta - Prove comparative e ibridi commerciali e sperimentali per produzione di granella e biomassa - Stime di ACG e ACS - Confronto quanti-qualitativo ibridi normali e bm3 - Valutazione della selezione in sintetiche migliorate per la dimensione della granella - Valutazione resistenza all’attacco di 1° e 2° generazione della piramide su ibridi sperimentali e commerciali e varietà sintetiche e studi delle relazioni ospite e parassita; stima danni produttivi - Identificazione fonti di resistenza al complesso virale MDMV-BYDM - Analisi della variabilità di genotipi di mais con aumentate caratteristiche nutrizionali (contenuto in antiossidanti e amido resistenti)
Miglioramento della qualità proteica del mais da granella Contesto tecnico scientifico Le proteine di riserva del seme di mais hanno un basso valore nutritivo per l’alimentazione umana e degli animali monogastrici in quanto carenti di lisina e triptofano. L’ottenimento di mais con una composizione aminoacidica più favorevole viene conseguito mediante interventi di ordine genetico. Le mutazioni endospermiche disponibili, in particolare la mutazione o2, che hanno una più equilibrata composizione aminoacidica costituiscono un buon materiale di partenza per l’ottenimento di ibridi migliorati da coltivare. Il cosiddetto “mais opaco” che ha tute le caratteristiche per essere considerato di buona qualità ai fini alimentari, presenta svantaggi di ordine pratico a causa della struttura farinosa del seme. La Sezione di Bergamo ha in corso di selezione sintetiche opache con fenotipo modificato che consentono di costituire ibridi di un certo interesse agronomico. Recentemente, i miglioratori genetici si sono impegnati a costituire ibridi con granella a frattura vitrea e sembra giustificata la costituzione di ibridi dotati di queste caratteristiche adatti agli ambienti italiani. Metodi utilizzati - Metodi di selezione ricorrente massale e per progenie FS, HS, S1, S2 - Metodi di selezione pedigree - Analisi genetica quantitativa - Metodi di valutazione della risposta alla selezione - Metodi di analisi della qualità della granella: contenuto proteico, DBC, contenuto in triptofano, resa alla macinazione - Metodi di estrazione e separazione delle proteine - Prove replicate - Prove di campo in disegni sperimentali - Metodi di elettroforesi mono e bidimensionale - Spettroscopia nel vicino infrarosso - Metodi di digeribilità enzimatica
Risultati - Miglioramento varietà sintetiche o2, DOo2, SSo2, MOD2, pool genetici A e B - Costituzione linee pure opache, ae-wx e da foraggio - Modelli per la stima della digeribilità, della sostanza organica per il trinciato integrale e del suo valore nutritivo - Costituzione di ibridi ad alto contenuto in olio e valutazione di progenie in selezione - Sviluppo di popolazioni con granella vitrea - Prove di attitudine combinatoria e della qualità della granella di ibridi costituiti con linee dotate di granella a frattura vitrea - Verifica di equazioni di calibrazione con spettroscopia NIR per la stima della composizione chimica e del valore nutritivo del trinciato integrale di mais su nuovi ibridi commerciali - Costituzione di ibridi a granella vitrea con elevata produttività e elevate caratteristiche tecnologiche - Miglioramento del modello predittivo per la stima del valore nutritivo della pianta intera di mais ad uso foraggero - Selezione di progenie ae - Metodi di selezione ricorrente - Analisi qualitativa su diversi genotipi di mais e valutazione resistenza a Fusarium moniliforme
Biologia cellulare, coltura in vitro e metodi di trasformazione genetica in specie cereali Contesto tecnico scientifico La presente attività di ricerca si sviluppa su due linee in parte in avanzamento parallelo, volte all’acquisizione di tecniche di routine per la trasformazione stabile di specie cereali. Una parte del lavoro, afferente più propriamente alla biologia cellulare, viene svolta per stabilire in vitro, colture ottimizzate embriogeniche rigenerabili nelle varie specie di interesse, settore che assume una dimensione propria in considerazione della difficoltà intrinseca delle specie cereali a rispondere in vitro. Un’altra parte di lavoro viene svolta in dipendenza dei materiali cellulari ottenuti, e consta della messa a punto di metodiche atte ad effettuare trasferimento genico stabile in colture cellulari di cereali e rigenerare, dopo selezione, eventi di trasformazione. Lo sviluppo, nell’ultimo quinquennio, di piante transgeniche per fattori di resistenza a stress biotici ed abiotici, e la loro introduzione nei programmi di miglioramento genico rende particolarmente attuale questo settore di ricerca che presenta un immediato risvolto applicativo sui programmi di breeding delle specie in questione. Lo sviluppo, nell’ultimo quinquennio, di piante transgeniche per fattori di resistenza a stress biotici ed abiotici, e la loro introduzione nei programmi di miglioramento genetico, rende particolarmente attuale questo settore di ricerca che presenta un immediato risvolto applicativo sui programmi di breeding delle specie in questione.
Metodi utilizzati - Tecniche di base di coltura in vitro: espianto, colture, rigenerazione di calli nelle varie specie - Stabilizzazione di colture cellulari in sospensione da calli selezionati friabili - sistemi a protoplasmi per studi di espressione transiente e per trasformazione stabile tramite trasferimento genico diretto PEG-mediato - Tecniche di trasformazione differenti, in dipendenza del materiale considerato: trasferimento genico diretto su protoplasmi, microbombardamento (particle gun) ed elettroporazione di tessuti maturi - Analisi biochimiche di rilevamento dell’attività dei geni marcatori introdotti (PAT-CAT-NPTII) - Tecniche di biologia molecolare per: isolamento DNA gnomico e plasmidico, analisi molecolare dei costrutti, analisi in Southern e PCR degli eventi di trasformazione - Fase di rigenerazione delle piante con allevamento in fitotrone e serra
Risultati - Colture embriogeniche rigenerabili in vari genotipi di mais, sorgo, riso, frumento tenero e frumento duro - Derivazione di colture ottimizzate (Tipo II friabili embriogeniche) nelle varie specie cereali - Stabilizzazione di colture in sospensione in particolare in mais, frumento tenero e frumento duro - Realizzazione di sistema a protoplasmi rigenerabili in frumento tenero - Coltura e rigenerazione di calli da varietà di frumento duro e conseguente stabilizzazione di colture in sospensione - Trasformazione stabile di frumento tenero e mais tramite trasferimento genico diretto in protoplasmi - Introduzione transiente e stabile di geni marcatori in colture embriogeniche di mais tramite microbombardamento (particle gun) ed elettroporazione - Analisi di geni, vettori e metodologie molecolari e genetiche per la caratterizzazione degli eventi di trasformazione
Analisi dei meccanismi genetici e molecolari che influenzano la sintesi delle proteine di riserva del seme di mais Contesto tecnico scientifico Nei cereali lo sviluppo del seme è il risultato di un preciso processo di differenziazione cellulare che porta alla formazione di due organi distinti, ma complementari: l’embrione e l’endosperma. Le dimensioni del seme del mais sono prevalentemente influenzate positivamente dal numero di cellule. Studi recenti suggeriscono che geni per istone deacetilasi (RPD3), retinoblastoma (pRb) e proteine associate al retinoblastoma (RbAp) svolgono un ruolo significativo nel determinismo dei processi di divisione di cellule endospermiche. L’impiego di mutazioni geniche ha permesso di chiarire alcuni aspetti del processo di sviluppo dell’embrione. Ulteriori indagini indicano che lo sviluppo dell’endosperma è composto da una serie di eventi sequenziali: formazione di granuli di amido, inizio della sintesi dei composti di riserva e endoreduplicazione. Nell’endosperma sono presenti distinte regioni funzionalmente attive nell’accumulo preferenziale di amido e proteine; l’accumulo di grassi è prevalentemente nell’embrione nello scutello. Le proteine di riserva del seme del mais sono state studiate dal punto di vista genetico, biochimico e nutrizionale e un’ampia attività è stata indirizzata a chiarire a livello genetico e molecolare i meccanismi che regolano la loro sintesi. In tal senso sono state descritte mutazioni geniche che hanno permesso di identificare geni regolatori che controllano la sintesi di proteine di riserva, la pigmentazione e la dormienza del seme. Sono state altresì descritte e caratterizzate mutazioni geniche che influenzano il trasporto e il flusso di fotosintati al seme e la loro rilocazione nelle cellule endospermiche e sono stati identificati geni e promotori tessuto-specifici coinvolti nel processo di trasporto di fotosintati. L’espressione dei geni strutturali che determina l’accumulo di proteine di riserva del seme appare influenzata da eventi di metilazione e dalla disponibilità di aminoacidi. Ulteriori indagini suggeriscono che l’espressione di una forma citosolica dell’enzima fosfoenolpiruvato dichinasi (PPDK) è, per esempio, attiva nel modulare il flusso di carbonio per la sintesi di amido e proteine. Lo studio di mutazioni endospermiche ha infine fornito informazioni per chiarire la sintesi dell’amido nel seme.
Metodi utilizzati - Mutagenesi traspositiva - Analisi genetica - Costruzione librerie genomiche e a cDNA - Traduzione in vitro RNA - Sequenziamento DNA - Band shift assay - DNaseI footprint - Tecniche elettroforetiche di separazione delle proteine - Preparazione anticorpi - Sistemi di espressione transiente - Mutagenesi sito-specifica - Tecniche di crescita in vitro di endospermi su substrati artificiali
Risultati - Induzione di mutazioni instabili al locus O2 - Clonaggio dell’allele o2-m5 - Purificazione e isolamento proteine b-32 - Analisi molecolare del locus O2 - Analisi molecolare del locus b-32 - Il locus O2 codifica per una DNA-binding protein della classe degli attivatori trascrizionali bZIP - Interazioni molecolari per il locus O2 e promotori b-32 e zeinici della classe 22 kDa - 3 uORF nel leader di O2 interferiscono con il livello di espressione di O2 - Espressione funzionale dell’attivatore trascrizionale O2 in Saccharomyces cerevisiae - Omologia di sequenza tra loci O2 di mais e sorgo - La proteine b-32 mostra omologia con proteine vegetali (RIPs) che interferiscono con la sintesi proteica - Le mutazioni fl2, Mc, e DeB30 influenzano il sistema di trasporto o assemblaggio delle zeine nei corpi proteici e inducono accumulo proteine b-70 che presenta omologie con cheperonine - Identificazione di regioni ipervariabili
Studio delle basi delle resistenze genetiche a stress biotici ed abiotici Contesto tecnico scientifico La costituzione di piante capaci di sottrarsi ai danni provocati da stress biotici ed abiotici, rappresenta un tradizionale obiettivo per i miglioratori genetici. Il presente tema di ricerca si prefigge di realizzare piante recanti geni per la resistenza a parassiti ingegnerizzati con geni codificanti per le proteine b-32, afp, cercopinA, pgip2, e lo studio dell’espressione di tali geni nei tessuti per l’eventuale conferimento di protezione contro patogeni. Parallelamente, per quanto riguarda i geni coinvolti nella resistenza agli stress abiotici, ne vengono studiati i meccanismi di regolazione accentrando gli studi sulla struttura del promotore ed esaminando l’attività del gene marcatore GUS nei prodotti di fusione promotore/GUS. Viene successivamente studiata nei vari organi della pianta, a vari stadi di sviluppo l’espressione dei costrutti ddi fusione, in modo da definire il tipo di attività, gli agenti ambientali inducenti l’espressione B-GUS nei tessuti, e di conseguenza i meccanismi di regolazione dell’espressione dei geni sotto indagine a livello di pianta intera.
Metodi utilizzati - Metodi di biologia molecolare per l’identificazione ed il clonaggio dei geni in esame - Costruzione, mediante tecniche di biologia molecolare, dei vettori utilizzati negli esperimenti di trasformazione ed analisi dell’espressione genica - Metodi di biologia molecolare per lo studio degli eventi di trasformazione - Tecniche di coltura in vitro e rigenerazione e tecniche di trasformazione mediante A.tumefaciens e mediante trasferimento genico diretto - Saggi di attività antifungina della proteina b-32 e di altri composti ad attività antimicrobica - Saggi di attività tossica della b-32 e di altri composti tossici su funghi - Tecnica di traduzione in vitro con ribosomi provenienti da funghi
Risultati - Dimostrazione dell’attività RIP della proteina b32 su ribosomi di lievito, neurospora e piralide - Messa a punto di un biodosaggio per la valutazione delle attività della b-32 in vivo su neurospora - Valutazione dell’effetto dei composti: sinigrina, glucotropeolina, glucosinolati di colza, saponina ed inibitore proteasico di colza, nella crescita di larve di Ostrinia nubilalis Hb, allevata in laboratorio; - Introduzione e analisi della b-32 in piante di tabacco modello per lo studio dell’effetto di protezione centro patogeni - Identificazione, clonaggio ed analisi molecolare di un gene HS da orzo ed identificazione, nel clone gnomico, della sequenza del promotore - Costruzione di vettori d’espressione comprendenti fusioni promotore/GUS con sequenza 5’ completa e versioni troncate per l’analisi transiente di espressione del gene marcatore regolato da trattamento termico - Introduzione del costrutto HS/GUS in piante modello di tabacco per lo studio della regolazione del promotore HS ad opera di vari agenti di stress abiotici, su vari tessuti e durante lo sviluppo della pianta - Introduzione del gene b-32 ingegnerizzato in mais, riso, frumento e valutazione degli eventi di trasformazione rispetto ai parentali di controllo - Studi di controllo ambientale con analisi della trasmissione del transgene alle specie selvatiche
Utilizzo di marcatori molecolari del dna nel miglioramento genetico della specie Contesto tecnico scientifico La necessità di individuare, identificare e caratterizzare col maggior dettaglio possibile sequenze nucleotidiche specifiche del DNA è un’esigenza che si è fatta sentire in diversi campi della ricerca applicata, compreso il miglioramento genetico delle piante agrarie, quale strumento di ausilio alla selezione genetica. Nel mais la presenza di uno straordinario grado di polimorfismo genetico per marcatori molecolari del DNA (RFLP, AFLP, SSR e SNP), può essere favorevolmente utilizzata per scomporre l’architettura genetica di caratteri complessi e agronomicamente importanti, rendendo eventualmente possibile una semplice analisi mendeliana degli stessi. Numerose osservazioni indicano, infatti, che i marcatori molecolari del DNA possono essere vantaggiosamente impiegati per migliorare l’efficienza della selezione sia di caratteri a base genetica semplice, quale ad esempio la resistenza agli insetti, sia per identificare blocchi genici che influenzano importanti caratteri agronomici, quale la produzione, la stabilità ambientale, la qualità del prodotto.
Metodi utilizzati - Metodi di analisi RFLP, SNP - Metodi di amplificazione PCR-RAPD, AFLP, SSR - Modelli di genetica quantitativa - Costruzione mappe di concatenazione - Associazione tra marcatori RFLP e caratteri quantitativi - Metodi di analisi multivariata - Analisi di Southern - Estrazione e digestione DNA genomico
Risultati - Allestimento di mappa genetica del mais - Sviluppo di metodologie per l’analisi di QTL - posizionamento di QTLs e caratteri semplici in mappe AFLP - Trasformazione di marcatori AFLP in marcatori SNP e loro impiego per analisi di polimorfismi - Sviluppo di modelli per l’analisi di QTLs in base ai dati di linkage disequilibrium ottenuti da SNP - Analisi relazione tra distanze genetiche e produzioni - Analisi della variabilità genetica su linee derivate da germoplasma Stiff Stalk Synthetic e Lancaster - Sviluppo di metodi di selezione assistita
Studio di alcuni sistemi interessanti il miglioramento genetico della specie Contesto tecnico scientifico L’attività di miglioramento genetico del mais viene adeguatamente fiancheggiata da alcune ricerche di genetica e biochimica per gruppi di mutazioni che interferiscono con la sintesi delle cere, dei carboidrati, delle proteine di riserva e di ricerche sugli elementi di controllo che condizionano la mutagenicità di trasposizione e di sviluppo di sistemi rapidi ed universali per l’ottenimento di ibridi F1 evitando il rilascio di polline transgenico nell’ambiente. Queste informazioni sono utili per chiarire i meccanismi genetici e biologici che determinano la sintesi di importanti composti e l’induzione di variabilità genetica al fine di una loro possibile applicazione pratica nei programmi di miglioramento genetico del mais.
Metodi utilizzati - Analisi genetiche - Mutagenesi traspositia - Analisi componenti cere - Separazione e purificazione proteine - Librerie gnomiche - Sequenze geniche - Analisi di Southern - Analisi clonale - Preparazione anticorpi - SDS-PAGE - IEF, elettroforesi 2D - Determinazione attività enzimatiche - Colture in vitro - Gene discovery - Mutator grids - Microarray - Analisi espressione genica
Risultati - Relazione tra vie metaboliche preposte alla sintesi delle cere superficiali - Caratteristiche genetiche del sistema di elementi trasponibili Bg-rbg - Capacità traspositiva del sistema di elementi trasponibili Bg-rbg - Clonaggio e caratteristiche molecolari del sistema con elementi trasponibili Bg-rgb - Caratterizzazione sistema elementi trasponibili Mu - Analisi linee cellulari che determinano la formazione della foglia - Colture embriogeniche rigenerabili per mais e altri cereali - Proprietà biochimiche di proteine endospermiche. - Analisi funzionale di ZmRpd3, RbAp, Rb - Caratterizzazione molecolare dei geni che controllano il ciclo delle cellule e del ruolo dell’acetilazione degli istoni nel controllo della trascrizione genica - Costituzione di piattaforme tecnologiche al servizio della genetica del seme - Costituzione di una banca dati con 7500 sequenze EST normalizzate derivate da endospermi di mais a diversi stadi di sviluppo - Isolamento di mutazioni instabili ai loci Gl1, Gl2, Gl3 - Caratterizzazione molecolare e funzionale dei geni Gl1 e Gl2 - Analisi dell’impiego di promotori specifici per le microspore e per il tapetum con esperimenti di trasformazione
Attività collaterali - Prove varietali, agrotecniche - Trasferimento risultati - Prove di iscrizione al Registro Varietale - Editoria internazionale Maydica; pubblica articoli afferenti alla genetica, miglioramento genetico e biologia molecolare del mais e specie affini - Rilievi dati meteorologici - Centro germoplasma: conservazione, utilizzazione e valorizzazione delle risorse genetiche maidicole e attività di supporto e complementarietà e studi avanzati sull’organizzazione del genoma del mais.
Collaborazioni I programmi di ricerca, oltre a rappresentare un’indispensabile fonte di finanziamento della Sezione, hanno favorito la crescita culturale e scientifica dei ricercatori, attraverso l’instaurarsi di proficue collaborazioni con altre istituzioni, tra queste si annoverano: - Istituto di Biosintesi Vegetali, CNR, Milano - Dipartimento di Fisiologia e Biochimica Generale, Facoltà di Scienze, Univ. Milano - Dipartimento di Biochimica Comparata, Facoltà di Scienze, Univ. Milano - Dipartimento di Produzioni vegetali, Facoltà di Agraria, Univ. Milano - Istituto di Genetica e botanica, Facoltà di Agraria, UCSC, Piacenza - Istituto Internazionale di Genetica e Biofisica, CNR, Napoli - Dipartimento di Chimica, Facoltà di chimica, Univ. La Sapienza, Roma - Dipartimento di Biologia e Patologia Vegetale, Univ. di Bari - Istituto Sperimentale per le Colture Foraggere, Lodi - Dipartimento di Agronomia Ambientale e Produzioni Vegetali, Univ. Padova - Istituto di Genetica e Sperimentazione Agraria “N. Strimpelli”, Lonigo (VI) - Max-Planck-Institut, Colonia, Germania - Institut of Plant Breeding, Univ. of Hohenheim, Stuttgart, Germany - Centre d’Investigacio i Desenvolypment, CSIC, Barcelona, Spagna - Istituto Sperimentale per la Frutticoltura, Roma - Dipartimento di Genetica e Microbiologia, Facoltà di Scienze, Univ. di Pavia - Dept. of Plant Physiology, Purdue University, West Lafayette, WI, USA - Dept. of Agronomy, Uowa state University, Ames, IA, USA - Cell Biology Department, University of Bristol, Long Ashton, Bristol, UK - AIS, ASSOSEME e Ditte Sementiere - Enti Regionali di Assistenza Agraria - Biogemma, Aubierre, France - Centro Interdisciplinare Studi Bio-molecolari e Applicazioni Industriali, Segrate, Milano - Dept. Mol. Biology, Larval University, Quebec, Canada - Dept. of Mol. Biology, University of Innsbruck, Medical School, Innsbruck, Austria - Institut for Plant Science, University of Gottingen, Germany |
